細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基，然后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢，觀(guān)察判斷細(xì)胞密度，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究?jī)?nèi)臟移植和免疫抑制。LY6G免疫熒光分析

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀(guān)察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使熒光減弱。2）每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：①陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn)，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。Aggrecan免疫組化IHC免疫熒光技術(shù)可以通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察樣品中的熒光信號(hào)，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。

直接免疫熒光：?jiǎn)慰贵w（一抗）用于免疫染色和檢測(cè)目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合，并使用成像顯微鏡觀(guān)察。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：由于無(wú)需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題。與間接免疫熒光相比，時(shí)間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點(diǎn)：不允許通過(guò)二抗進(jìn)行信號(hào)放大；檢測(cè)靈敏度降低；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測(cè)相比，更昂貴。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進(jìn)行免疫染色并檢測(cè)目標(biāo)蛋白。首先，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白。然后，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識(shí)別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個(gè)以上的二抗可以與一抗結(jié)合，熒光信號(hào)被放大，提供了更高的檢測(cè)靈敏度。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱(chēng)為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱(chēng)熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱(chēng)熒光抗原法。這兩種方法總稱(chēng)免疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱(chēng)為熒光抗體技術(shù)，或稱(chēng)為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱(chēng)為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測(cè)定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、多肽、核酸、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類(lèi)別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測(cè)、免疫學(xué)、血型鑒定等。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對(duì)樣本進(jìn)行封閉，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過(guò)夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時(shí)需要加二抗處理，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑，封片。可立即觀(guān)察后暫存4℃盡快觀(guān)察。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。SERPINF1免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。LY6G免疫熒光分析

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋?zhuān)ＷC抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過(guò)1：20，抗體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結(jié)果的觀(guān)察。染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10min到數(shù)小時(shí)，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染色過(guò)夜較37℃30min效果好的多。LY6G免疫熒光分析

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