應(yīng)用場景：單克隆抗體藥物輔助篩選；致xingbing毒整合位點(diǎn)檢測與整合偏好性分析等；WGS不適用于轉(zhuǎn)染之后未經(jīng)過傳代培養(yǎng)和表型篩選的細(xì)胞系。豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)?zāi)壳埃梢雅c國內(nèi)外多家免疫zhiliao研究前沿企業(yè)開展合作，采用該方法對高度異質(zhì)性的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行整合位點(diǎn)檢測與細(xì)胞安全性評估，具有較為豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)。一般HBV插入到基因組中形成下圖結(jié)構(gòu)。使用三代測序，靶向插入?yún)^(qū)域的測序reads可分為Readsgroup1（HBV插入?yún)^(qū)域測通）和Readsgroup2（reads部分比對染色體，部分比對HBV插入?yún)^(qū)域）?；谌鷶?shù)據(jù)比對后bam文件的IGV圖，判斷變異類型，推斷斷點(diǎn)類型和插入序列。在靶向CD19的CAR-T臨床試驗(yàn)中,慢病毒傳染的CAR-T整合位點(diǎn)顯示出更的抗效力。南通ISA整合位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

基因編輯產(chǎn)品建議觀察15年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風(fēng)險(xiǎn)。?腺相關(guān)病毒載體建議觀察5年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風(fēng)險(xiǎn)。以上長期隨訪時(shí)間的建議主要基于基因zhiliao的產(chǎn)品類型，具體產(chǎn)品的隨訪時(shí)間取決于產(chǎn)品的特性和體內(nèi)存在時(shí)間、轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間、遲發(fā)性不良反應(yīng)的預(yù)期時(shí)間及發(fā)生率、受試者適應(yīng)癥和預(yù)期生存期、給藥途徑、以及長期隨訪的其他觀察目的。隨著隨訪數(shù)據(jù)的積累，研究者和研究申辦方可能會根據(jù)產(chǎn)品的存在情況、轉(zhuǎn)基因表達(dá)和臨床表現(xiàn)的持續(xù)評估情況，延長或縮短長期隨訪的持續(xù)時(shí)間。如果研究申辦方認(rèn)為其基因zhiliao產(chǎn)品安全性風(fēng)險(xiǎn)較低、無需開展長期隨訪臨床研究，或者希望變更隨訪時(shí)間，應(yīng)合理說明依據(jù)或變更理由并與藥品監(jiān)督管理部門進(jìn)行溝通。南通ISA整合位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室慢病毒載體在人角質(zhì)形成細(xì)胞基因組中的整合位點(diǎn)分析。

相較于LM-PCR方法，重組細(xì)胞全基因組重測序需要較大數(shù)據(jù)量，比較適合用于經(jīng)過表型篩選的單克隆細(xì)胞的測序，比如用于抗體藥物生產(chǎn)重組CHO細(xì)胞的位點(diǎn)檢測，但全基因組測序可對宿主基因組自身的變異進(jìn)行檢測。應(yīng)用場景：CAR-T細(xì)胞安全性檢測（藥物申報(bào)）；基因zhiliao研究中使用的病毒性載體的安全性檢測等；1.LM-PCR不適合評估每個(gè)整合位點(diǎn)插入序列發(fā)生的變異，不適用于插入序列的拷貝數(shù)檢測，拷貝數(shù)檢測可以采用qPCR方法進(jìn)行。2.INZR-WGS（WGS法）

例如，對于經(jīng)過基因修飾的免疫細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品如CAR-T，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)和流式細(xì)胞術(shù)（Flowcytometry）進(jìn)行PK分析，分別通過測定外源基因拷貝和CAR+細(xì)胞數(shù)量的變化，有助于互相驗(yàn)證檢測方法的可靠性，可以更duomian的分析產(chǎn)品在體內(nèi)的擴(kuò)增和存活情況。對于大多數(shù)免疫細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品，可以通過細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答分析藥效學(xué)活性。有多個(gè)特異性靶點(diǎn)的zhiliao產(chǎn)品，應(yīng)分析其對每個(gè)靶點(diǎn)的作用活性。如果細(xì)胞經(jīng)體外基因修飾，在體內(nèi)分泌特定蛋白、多肽或其它活性成分，或敲除了特定基因的表達(dá)，也需要進(jìn)行針對性的藥效學(xué)分析，如檢測特定蛋白的活性、持續(xù)時(shí)間和變化情況等。通過分選CAR-T 細(xì)胞,對T細(xì)胞受體(TCR)β鏈庫進(jìn)行深度測序(TCR-seq)以及慢病毒載體整合位點(diǎn)(LVIS)分析。

免疫細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)水平與多種因素有關(guān)，如細(xì)胞來源和類型、體內(nèi)活性和存活時(shí)間、是否有外源基因表達(dá)、基因表達(dá)使用的載體類型以及是否存在基因組整合等。針對不同風(fēng)險(xiǎn)水平的免疫細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品，隨訪持續(xù)時(shí)間的建議如下：?對于沒有外源基因表達(dá)、且體外操作不改變細(xì)胞存活時(shí)間及分化潛能的免疫細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品，長期隨訪的持續(xù)時(shí)間不應(yīng)短于細(xì)胞在體內(nèi)的自然存活時(shí)間，建議對受試者進(jìn)行1年或以上的隨訪。22?對于有外源基因表達(dá)、但不存在基因整合或基因重組風(fēng)險(xiǎn)，或載體的基因整合或重組風(fēng)險(xiǎn)較低的免疫細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品，建議對受試者進(jìn)行不少于5年的隨訪。?對于有外源基因表達(dá)、而且表達(dá)載體存在基因整合或有基因重組風(fēng)險(xiǎn)的免疫細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品，建議對受試者觀察不少于15年。整合位點(diǎn)相比γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒更安全，成本更高。南通LV整合位點(diǎn)分析

整合位點(diǎn)分析,基因和細(xì)胞的安全指南。南通ISA整合位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

慢病毒整合事件要素及檢測方法要求：對于食藥監(jiān)局指導(dǎo)性文件和既往研究內(nèi)容，我們不難發(fā)現(xiàn)對于慢病毒整合檢測所謂整合事件至少包含三個(gè)要素：整合位置；整合方向；特定整合位置和整合方向的juedui克隆數(shù)目；因此檢測在定性和定量性能方面都有要求，檢測方法需要結(jié)合臨床樣本進(jìn)行分析性能進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證。慢病毒整合位點(diǎn)檢測方法，目前檢測慢病毒整合位點(diǎn)的主要平臺為高深度測序（NGS)。而目前較為成熟已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)產(chǎn)品檢測及臨床研究的整合位點(diǎn)富集建庫方法為機(jī)械片段化及依賴于接頭的擴(kuò)增子建庫(LM-PCR,如INSPIIRED),已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)CART19臨床項(xiàng)目的安全性評估及與CAR-T細(xì)胞增值相關(guān)的回顧yao效學(xué)分析。南通ISA整合位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室