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來源: 發(fā)布時間:2021-11-13

如何高效率實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染:瞬時轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)根據(jù)基因表達時間的長短可分為兩大類,一類是瞬時轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(很長轉(zhuǎn)染)。瞬時轉(zhuǎn)染的細胞中,外源基因得以表達但它們并不會整合到細胞的基因組中,也就不會被復制。細胞中瞬時轉(zhuǎn)染的外源基因表達時間有限,通常*持續(xù)幾天,直到外源基因在細胞分裂過程中因各種因素丟失為止。在瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個報告基因,來指示細胞中目標基因是否存在,這樣的報告基因一般可以在轉(zhuǎn)染后一兩天內(nèi)檢測到。轉(zhuǎn)染試劑與細胞不匹配細胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細胞。徐州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷

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細胞轉(zhuǎn)染,你至少要掌握以下幾點:主要有下面幾種方法::化學法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法;物理法:電穿孔法、顯微注射法、顆粒傳遞法;細菌介導法:逆轉(zhuǎn)錄細菌、腺細菌A. 陽離子脂質(zhì)體法:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內(nèi)吞。特點:簡單通用,適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復性好,但轉(zhuǎn)染時需除血清,轉(zhuǎn)染效率隨細胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞,所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。B. 電穿孔法:利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾,使其形成利于核酸進入的微孔。徐州細胞高效轉(zhuǎn)染試劑報價瞬時表達分析所需的人力和時間比穩(wěn)定表達少。

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轉(zhuǎn)染的注意事項:瞬時和穩(wěn)定表達DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達可以在1-4天內(nèi)檢測到。*有一部分轉(zhuǎn)入細胞的DNA被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄并較終輸出mRNA到細胞質(zhì)進行蛋白合成。幾天內(nèi),大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細胞分裂而稀釋;一周后就檢測不到其存在了。瞬時表達分析檢測未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達。因此,表達水平與位臵無關(guān),不會受到周圍染色體元件的影響。瞬時表達分析所需的人力和時間比穩(wěn)定表達少,但因為DNA攝入效率和表達水平在不同實驗中差異較大,實驗必須很小心。為了進行穩(wěn)定表達,轉(zhuǎn)入的基因必須能和細胞同步復制。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時就會如此。在一小部分轉(zhuǎn)染的細胞中,加入的DNA通過重組整合到基因組上。包含整合DNA的細胞很少,必須通過對藥物的抗性篩選進行擴增或通過表型變化進行鑒定。

細胞轉(zhuǎn)染的常用方法:細菌轉(zhuǎn)染:原理:對于用脂質(zhì)體不能實現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細胞,可以采用細菌轉(zhuǎn)染??捎糜诘鞍踪|(zhì)過表達或克制,是臨床研究中較常用的方法。它通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中,可用于難轉(zhuǎn)染細胞、原代細胞的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染。實驗步驟:通過基因克隆生成重組細菌 → 采用非細菌法轉(zhuǎn)染包裝細胞系,擴增并分離得到重組細菌顆?!兓⒌味毦骸D(zhuǎn)導目的細胞(含有細菌特異性的受體)→去除培養(yǎng)物中的細菌,并加入新鮮培養(yǎng)基→分析細胞瞬時基因表達或沉默情況。使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長。

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細胞轉(zhuǎn)染操作方法:轉(zhuǎn)染 ,是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰毎姆独?;化學介導方法很多,如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術(shù);生物介導方法,有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種細菌介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細胞轉(zhuǎn)染方法,應該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。細菌介導的轉(zhuǎn)染技術(shù),是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法,同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是,細菌轉(zhuǎn)染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點。建議選擇50%~80%區(qū)間密度進行細胞轉(zhuǎn)染。珠海細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家好

在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。徐州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷

細胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清:不同的細胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同 的。較好是在靠前次實驗前做一個預實驗,比如:HeLa,293,CHO,COS7, MCF-7,HepG2等細胞,是否加血清,對不同的細胞是有不同的影響的,有些細胞是可以有血清的,有些加血清就會受影響。轉(zhuǎn)染后在6小時左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基,其一因為普通轉(zhuǎn)染試劑對細胞的毒性作用大,其二可降低因血清的缺乏引起的細胞的死亡。轉(zhuǎn)染時不加血清是防止血清的干擾作用,轉(zhuǎn)染后可適時加入。加入過早會引起未轉(zhuǎn)染細胞的優(yōu)勢生長,過晚會引起較多細胞死亡??蓪崟r觀察1/5細胞變圓的時候加入血清。徐州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷

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與原代細胞相關(guān)的擴展資料:

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原代細胞(primary culture cell)是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。有人把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫(yī)學基礎研究,如蛋白質(zhì)組學、基因組學、細胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學研究等,還可應用于當今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、**藥物的研究等。原代細胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用,市場前景廣闊。
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