多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足。只能對(duì)熒光成像。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團(tuán)，如色素，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低，雖然可以通過(guò)同時(shí)利用共焦的小孔得到改善，但是信號(hào)會(huì)有損耗。受昂貴的超快激光器限制，多光子掃描顯微鏡的成本較高。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例。動(dòng)物和腦片神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、動(dòng)物腦皮層的成像、胚胎發(fā)育過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)、多光子激發(fā)光解籠、細(xì)胞內(nèi)微區(qū)鈣動(dòng)力學(xué)、多光子激發(fā)自發(fā)熒光、其它應(yīng)用。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線(xiàn)性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱(chēng)為多光子顯微鏡。共聚焦多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

對(duì)兩個(gè)遠(yuǎn)距離（相距大于1-2mm）的成像部位，通常使用兩條單獨(dú)的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)事后光源分離方法或時(shí)空復(fù)用方法來(lái)解決。事后光源分離方法指的是用算法來(lái)分離光束消除串?dāng)_；時(shí)空復(fù)用方法指的是同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上延遲，這樣就可以暫時(shí)分離被不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)。引入越多路光束就可以對(duì)越多的神經(jīng)元進(jìn)行成像，但是多路光束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間的重疊增加，從而限制了區(qū)分信號(hào)源的能力；并且多路復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來(lái)維持近似單光束的信噪比，這會(huì)容易導(dǎo)致組織損傷。飛秒激光多光子顯微鏡三維分辨率多光子顯微鏡的發(fā)展現(xiàn)狀及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。

多光子激發(fā)的特點(diǎn)。激發(fā)波長(zhǎng)∶兩個(gè)或多個(gè)光子同時(shí)激發(fā)，激發(fā)波長(zhǎng)是單光子激發(fā)波長(zhǎng)的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）。多光子激發(fā)∶依賴(lài)于多個(gè)光子同時(shí)到達(dá)的時(shí)間。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16seconds），且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點(diǎn)處，能滿(mǎn)足多個(gè)光子同時(shí)達(dá)到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強(qiáng)度正比于（激光強(qiáng)度）n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器，皮秒脈沖不能實(shí)現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū)，對(duì)細(xì)胞毒性和光漂白更小。

在多光子顯微鏡（也稱(chēng)為非線(xiàn)性或雙光子顯微鏡）中，以?xún)杀墩＜ぐl(fā)波長(zhǎng)照射樣品。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢愿畹卮┩笜悠愤M(jìn)行3D成像，并且因?yàn)樗鼈儾粫?huì)損壞樣品，從而延長(zhǎng)樣品壽命。為了實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā)，照明光束在空間上聚焦（使用光學(xué)器件），同時(shí)使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個(gè)（或更多）光子同時(shí)到達(dá)同一位置（即熒光團(tuán)分子）的概率。多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生(SHG)、三次諧波產(chǎn)生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微技術(shù)。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學(xué)組件很重要，并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低GDD特性。光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。

對(duì)于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問(wèn)題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來(lái)，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。從產(chǎn)品類(lèi)型及技術(shù)方面來(lái)看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場(chǎng)。共聚焦多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

多光子顯微鏡在基礎(chǔ)科學(xué)和臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用范圍正在持續(xù)增長(zhǎng)。共聚焦多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

多光子顯微鏡通過(guò)引入具有超高透射率、非常陡峭的邊緣和精心優(yōu)化的阻擋的濾光片，為多光子用戶(hù)帶來(lái)了增強(qiáng)的性能。考慮到激發(fā)激光器和多光子成像系統(tǒng)的其他復(fù)雜元件通常需要多少投資，這些新的光學(xué)濾光片**了一種簡(jiǎn)單且廉價(jià)的升級(jí)，可以顯著提高系統(tǒng)性能。事實(shí)上，與傳統(tǒng)濾光片的褐**調(diào)相比，發(fā)射濾光片看起來(lái)像窗戶(hù)玻璃一樣清晰，而且LWP二向色鏡具有如此寬的反射帶，它們看起來(lái)像高反射鏡。發(fā)射濾光片還在Ti:Sapphire激光調(diào)諧范圍內(nèi)提供深度阻擋，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)高信噪比和測(cè)量靈敏度至關(guān)重要。共聚焦多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)