20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴(lài)于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式來(lái)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以?xún)?nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)***定量分析。肺*T790M突變-cfDNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。天津拷貝數(shù)變異數(shù)字PCR怎么樣
值得注意的是，在gDNA長(zhǎng)度≥20kb或進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須對(duì)樣品進(jìn)行酶切處理，確保大片段DNA序列或串聯(lián)序列在酶切處理后，模板隨機(jī)且均勻的進(jìn)入**反應(yīng)體系，以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)離不開(kāi)包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反應(yīng)所需要的MasterMix。隨著實(shí)驗(yàn)的不斷深入，對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件的要求也不斷提高，其中DNA聚合酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用。由于非熱啟動(dòng)的DNA聚合酶在反應(yīng)體系易使引物在室溫條件下發(fā)生非特異性擴(kuò)增，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。四川PCR數(shù)字PCR售后服務(wù)市場(chǎng)想象空間大，國(guó)內(nèi)外入局者眾多。
*****的實(shí)時(shí)監(jiān)控：已有數(shù)篇文章報(bào)道了使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)患者***過(guò)程中的循環(huán)**DNA（ctDNA）進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)監(jiān)控疾病進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺*、乳腺*和腸*等多種**患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學(xué)及其他常規(guī)指標(biāo)相比，ctDNA突變及豐度改變通常會(huì)提前數(shù)月出現(xiàn)，這樣就可以提醒醫(yī)生及時(shí)調(diào)整***方案，使患者得到更有效的***。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查：唐氏綜合征、地中海貧血或胎兒遺傳性耳聾基因檢測(cè)等，目前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源主要為孕婦血液，檢測(cè)胎兒DNA會(huì)受到母體DNA的干擾，依靠數(shù)字PCR可提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。對(duì)比NGS，數(shù)字PCR技術(shù)可以提高工作效率、降低檢測(cè)成本。
該技術(shù)提出至今雖然只有十幾年時(shí)間，但是由于其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景，使得其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展相當(dāng)迅速。迄今為止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字 PCR 產(chǎn)品，并已經(jīng)應(yīng)用于單細(xì)胞分析、**早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領(lǐng)域。目前，有關(guān)數(shù)字 PCR 技術(shù)的綜述類(lèi)文獻(xiàn)并不多見(jiàn)，本文將在現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對(duì)該技術(shù)的原理、定量方法、分類(lèi)及應(yīng)用進(jìn)行評(píng)述，并對(duì)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。數(shù)字 PCR 技術(shù)提出至今，相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速。迄今為止，數(shù)字 PCR 技術(shù)主要有三類(lèi): 微反應(yīng)室/孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。高效篩查胎兒疾病，提高無(wú)創(chuàng)產(chǎn)檢普及性和依從性。
數(shù)字PCR是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，借助微液滴或微坑，通過(guò)單個(gè)模板分子的PCR擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)不依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本的準(zhǔn)確、***定量。數(shù)字PCR使得反應(yīng)更靈敏、結(jié)果更可靠、展示更直觀，尤其適用于微量或痕量DNA檢測(cè)與定量。基因表達(dá)差異研究：數(shù)字PCR可以提供比實(shí)時(shí)熒光定量PCR更精確的基因差異表達(dá)研究，尤其對(duì)于那些靶基因表達(dá)差異微小的情況，如：mRNA、microRNA、lncRNAs等的表達(dá)分析；等位基因的不平衡表達(dá)；單細(xì)胞基因表達(dá)分析；外泌體核酸分子定量分析等。制藥公司巨頭羅氏等也有數(shù)字PCR產(chǎn)品在研。云南拷貝數(shù)變異數(shù)字PCR口碑推薦
增加引物或探針的Tm值，從而實(shí)現(xiàn)更短的引物和探針設(shè)計(jì)。天津拷貝數(shù)變異數(shù)字PCR怎么樣
單細(xì)胞的基因表達(dá)分析：基因表達(dá)分析有助于了解細(xì)胞和組織的特征及其如何應(yīng)對(duì)發(fā)育和環(huán)境信號(hào)的改變。檢測(cè)已知和未知基因轉(zhuǎn)錄水平的方法在過(guò)去的四十多年來(lái)發(fā)生了翻天覆地的變化，變得更加有效，更加敏感，定量更加精細(xì)，能夠一次性對(duì)大量的基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。但是，在組成復(fù)雜的細(xì)胞混合物中，盡管***表達(dá)的基因可以被識(shí)別出來(lái)，但來(lái)自于少數(shù)細(xì)胞群體（例如干細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄本卻很可能會(huì)被掩蓋掉，尤其是在每個(gè)細(xì)胞中以低豐度形式出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本。為了解決這個(gè)問(wèn)題，單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用而生，而且逐漸受到了越來(lái)越多的重視。ddPCR在單細(xì)胞分析中的優(yōu)勢(shì)在于它不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線就能進(jìn)行***定量。而且，由于能夠以非常高的敏感性區(qū)分至少五種不同的基因轉(zhuǎn)錄本，因此無(wú)需進(jìn)行其他方法所要求的單細(xì)胞cDNA預(yù)擴(kuò)增，這可以消除預(yù)擴(kuò)增和NGS文庫(kù)準(zhǔn)備中潛在的轉(zhuǎn)錄本定量失真，能夠能加真實(shí)的反映單細(xì)胞群體中關(guān)鍵基因的特征。天津拷貝數(shù)變異數(shù)字PCR怎么樣