industryTemplate常見(jiàn)的300種人、小鼠和大鼠基因表達(dá)Assay均已在QIAcuity數(shù)字PCR平臺(tái)上經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。天津Digital PCR數(shù)字PCR服務(wù)
與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對(duì)廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測(cè)方法，我們?cè)诳创龜?shù)字PCR的應(yīng)用前景時(shí)，更應(yīng)該保持一種開(kāi)放的心態(tài)，與其說(shuō)數(shù)字PCR技術(shù)是一個(gè)新的檢測(cè)平臺(tái)，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個(gè)平臺(tái)上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，其具有諸多優(yōu)勢(shì)：（1）***定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線，定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；（2）高靈敏度，可實(shí)現(xiàn)單分子級(jí)檢測(cè)；（3）高分辨率，適合在大量背景模板的干擾下對(duì)罕見(jiàn)的目標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)；（4）高穩(wěn)定性，對(duì)抑制劑的耐受程度**增強(qiáng)。憑借這些優(yōu)勢(shì)，數(shù)字PCR被廣泛應(yīng)用于多個(gè)不同的領(lǐng)域[4]，特別是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括稀有突變檢測(cè)、基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)、基因表達(dá)研究、甲基化水平檢測(cè)、**液體活檢、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)、微生物（病毒、細(xì)菌等）檢測(cè)、移植排斥監(jiān)控和二代測(cè)序輔助建庫(kù)等。此外，此技術(shù)也被用于農(nóng)業(yè)、食品安全和環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域。PCR數(shù)字PCR共同合作一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬(wàn)個(gè)單元中進(jìn)行反應(yīng)。
值得注意的是，在gDNA長(zhǎng)度≥20kb或進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須對(duì)樣品進(jìn)行酶切處理，確保大片段DNA序列或串聯(lián)序列在酶切處理后，模板隨機(jī)且均勻的進(jìn)入**反應(yīng)體系，以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)離不開(kāi)包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反應(yīng)所需要的MasterMix。隨著實(shí)驗(yàn)的不斷深入，對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件的要求也不斷提高，其中DNA聚合酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用。由于非熱啟動(dòng)的DNA聚合酶在反應(yīng)體系易使引物在室溫條件下發(fā)生非特異性擴(kuò)增，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式來(lái)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)***定量分析。通過(guò)直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式計(jì)算得到樣品的原始濃度或含量。
ddPCR主要有Bio-rad公司開(kāi)發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬(wàn)個(gè)微滴，Rain Drop可以分割成100萬(wàn)-1 000萬(wàn)個(gè)微滴。ddPCR原理是通過(guò)將一個(gè)待分析的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個(gè)油包水小微滴從而對(duì)原始體系進(jìn)行分割，樣品中的核酸分子隨機(jī)分配到大量**的微滴中，每個(gè)微滴中含有一個(gè)或不含待檢核酸分子。對(duì)微滴體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以后，分析每個(gè)微滴的熒光信號(hào)，進(jìn)行有或無(wú)的判斷，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過(guò)讀取靶標(biāo)和內(nèi)參核酸的陽(yáng)性微滴個(gè)數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)，也保證一定程度上的微滴檢測(cè)穩(wěn)定性。影響引物探針特異性的因素有很多種，譬如純化方式、設(shè)計(jì)方法以及引物探針的修飾技術(shù)等。PCR數(shù)字PCR共同合作
開(kāi)發(fā)多靶點(diǎn)檢測(cè)的多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)，可以通過(guò)多種熒光染料或標(biāo)記技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。天津Digital PCR數(shù)字PCR服務(wù)
單細(xì)胞的基因表達(dá)分析：基因表達(dá)分析有助于了解細(xì)胞和組織的特征及其如何應(yīng)對(duì)發(fā)育和環(huán)境信號(hào)的改變。檢測(cè)已知和未知基因轉(zhuǎn)錄水平的方法在過(guò)去的四十多年來(lái)發(fā)生了翻天覆地的變化，變得更加有效，更加敏感，定量更加精細(xì)，能夠一次性對(duì)大量的基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。但是，在組成復(fù)雜的細(xì)胞混合物中，盡管***表達(dá)的基因可以被識(shí)別出來(lái)，但來(lái)自于少數(shù)細(xì)胞群體（例如干細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄本卻很可能會(huì)被掩蓋掉，尤其是在每個(gè)細(xì)胞中以低豐度形式出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本。為了解決這個(gè)問(wèn)題，單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用而生，而且逐漸受到了越來(lái)越多的重視。ddPCR在單細(xì)胞分析中的優(yōu)勢(shì)在于它不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線就能進(jìn)行***定量。而且，由于能夠以非常高的敏感性區(qū)分至少五種不同的基因轉(zhuǎn)錄本，因此無(wú)需進(jìn)行其他方法所要求的單細(xì)胞cDNA預(yù)擴(kuò)增，這可以消除預(yù)擴(kuò)增和NGS文庫(kù)準(zhǔn)備中潛在的轉(zhuǎn)錄本定量失真，能夠能加真實(shí)的反映單細(xì)胞群體中關(guān)鍵基因的特征。天津Digital PCR數(shù)字PCR服務(wù)