數(shù)字PCR可以直接計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無(wú)需依賴于對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的***定量檢測(cè)；此外，由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)*判斷有/無(wú)兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線的交點(diǎn)，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響**降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力**提高；數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過(guò)程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競(jìng)爭(zhēng)性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變。轉(zhuǎn)基因食品或成分的檢測(cè)。浙江核酸拷貝數(shù)定量數(shù)字PCR
ddPCR主要有Bio-rad公司開(kāi)發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬(wàn)個(gè)微滴，Rain Drop可以分割成100萬(wàn)-1 000萬(wàn)個(gè)微滴。ddPCR原理是通過(guò)將一個(gè)待分析的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個(gè)油包水小微滴從而對(duì)原始體系進(jìn)行分割，樣品中的核酸分子隨機(jī)分配到大量**的微滴中，每個(gè)微滴中含有一個(gè)或不含待檢核酸分子。對(duì)微滴體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以后，分析每個(gè)微滴的熒光信號(hào)，進(jìn)行有或無(wú)的判斷，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過(guò)讀取靶標(biāo)和內(nèi)參核酸的陽(yáng)性微滴個(gè)數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)，也保證一定程度上的微滴檢測(cè)穩(wěn)定性。廣東高靈敏度數(shù)字PCR共同合作可以用于白血病融合基因檢測(cè)。
數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用***定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測(cè)方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到***的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、**標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫(kù)精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。
該技術(shù)提出至今雖然只有十幾年時(shí)間，但是由于其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景，使得其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展相當(dāng)迅速。迄今為止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字 PCR 產(chǎn)品，并已經(jīng)應(yīng)用于單細(xì)胞分析、**早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領(lǐng)域。目前，有關(guān)數(shù)字 PCR 技術(shù)的綜述類文獻(xiàn)并不多見(jiàn)，本文將在現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對(duì)該技術(shù)的原理、定量方法、分類及應(yīng)用進(jìn)行評(píng)述，并對(duì)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。數(shù)字 PCR 技術(shù)提出至今，相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速。迄今為止，數(shù)字 PCR 技術(shù)主要有三類: 微反應(yīng)室/孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。DNA聚合酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用。
從上世紀(jì)90年代以來(lái)qPCR技術(shù)的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測(cè)技術(shù)具有全新的面貌，而進(jìn)入二十一世紀(jì)之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測(cè)序技術(shù)正在迅速發(fā)展，也是目前競(jìng)爭(zhēng)**為激烈的研究領(lǐng)域之一，即使在這種情況下，dPCR技術(shù)仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學(xué)領(lǐng)域爭(zhēng)取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統(tǒng)的qPCR應(yīng)用領(lǐng)域，也有一些實(shí)驗(yàn)室同時(shí)選擇dPCR平臺(tái)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確和可重復(fù)性。在基因組變異研究領(lǐng)域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測(cè)面臨的問(wèn)題主要是突變序列往往與大量正常序列同時(shí)存在，競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)嚴(yán)重影響突變序列的檢測(cè)精度，數(shù)字PCR技術(shù)帶來(lái)的極高的擴(kuò)增特異性在稀有突變檢測(cè)方面具有天然的優(yōu)勢(shì)，在**標(biāo)志物檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測(cè)等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。近年來(lái)，Bio-Rad、凱杰、賽默飛等巨頭公司紛紛通過(guò)收購(gòu)、投資等方式布局?jǐn)?shù)字PCR業(yè)務(wù)。浙江數(shù)字PCR數(shù)字PCR服務(wù)
提取外泌體也是個(gè)非常費(fèi)時(shí)費(fèi)錢的事情。浙江核酸拷貝數(shù)定量數(shù)字PCR
拷貝數(shù)變異(CNV)研究：數(shù)字PCR直接讀取陽(yáng)性信號(hào)，通過(guò)泊松分布校正得到目標(biāo)基因的***拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了***的檢測(cè)精度。采用數(shù)字PCR能夠有效對(duì)二代測(cè)序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并具有檢測(cè)周期短、成本低、樣本通量高等特點(diǎn)。低豐度DNA模板分子的精確定量：由于絕大部分微液滴中只含單個(gè)或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴(kuò)增不受高豐度模板分子擴(kuò)增的競(jìng)爭(zhēng)抑制：與此同時(shí)，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過(guò)程中進(jìn)行了相對(duì)稀釋，作用于單個(gè)微液滴內(nèi)模板擴(kuò)增的抑制劑數(shù)量大幅降低，從而提高PCR擴(kuò)增對(duì)抑制劑的耐受程度，因此可應(yīng)用于諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標(biāo)記物的檢測(cè)。一般而言，定量PCR的檢測(cè)靈敏度約在1%，NGS的靈敏度可達(dá)到1%，而數(shù)字PCR的檢測(cè)下限可輕松實(shí)現(xiàn)0.01%。浙江核酸拷貝數(shù)定量數(shù)字PCR