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來源: 發(fā)布時間:2021-11-21

甲基化特異性PCR(MS-PCR)


DNA在亞硫酸氫鹽作用后,DNA CpG若無甲基化,則序列中的C改變?yōu)閁,若有甲基化則保持不變,因此從理論上講,用不同的引物做PCR,即可檢測出這種差異,從而確定基因有無CpG島甲基化。因此根據(jù)目的基因修飾前后的改變,就可以相應設計M和U引物,有時我們需要設計兩輪引物。


這種方法靈敏度高,無需特殊儀器,因此經(jīng)濟實用,是目前應用**為***的檢測方法。不過也存在一定的局限性,預先需要知道待測片段的DNA序列,引物的設計非常重要。另外,亞硫酸氫鹽處理也十分關鍵,若處理不完全則可能導致假陽性的出現(xiàn)。 DNA甲基化是生物界神奇的“帽子”。遼寧RIP-seq技術服務口碑推薦

    將待測DNA經(jīng)過亞硫酸鹽處理,通過PCR擴增過程引入T7啟動子序列,經(jīng)T7DNA聚合酶的體外轉錄過程得到各樣本RNA產(chǎn)物,經(jīng)堿基特異性酶切處理,得到RNA小片段,并用飛行質譜檢測每個片段的分子量,***EpiTYPER程序完成數(shù)據(jù)的自動化處理并報告每個檢測片段的甲基化程度。技術優(yōu)勢·檢測片段長:擴增片段長度可達500bp·高靈敏度:可發(fā)現(xiàn)低至5%甲基化水平,樣本起始量低至10ng?!ぶ貜托院茫鹤儺愊禂?shù)CV≤5%?!じ咝詢r比:用384孔板進行PCR反應,一個擴增產(chǎn)物可以進行多重CpG位點分析,無需后續(xù)驗證,可直接用于文章發(fā)表。服務內容1.根據(jù)客戶提供的序列信息進行預評估;2.進行樣本DNA的分離、純化、質檢及亞硫酸鹽修飾。3.使用特殊設計的一對引物擴增樣本,得到帶有T7RNA聚合酶啟動子序列的擴增產(chǎn)物。4.在體外轉錄體系中,利用T7RNA聚合酶,將擴增產(chǎn)物轉錄為RN**斷。5.利用RNaseA能夠特異性識別并切割RNA中U3’端的特性,將RN**斷切割成攜帶有CpG位點的小片斷。6.使用sequenom®MassArray飛行質譜分析系統(tǒng)檢測產(chǎn)物。由于同一片斷中,只有CpG和CpA之間16Da的分子量差別,即質譜圖中兩者峰的差距。 江蘇MeDIP-Seq技術服務經(jīng)驗豐富不同的芯片平臺,各自的實驗過程也是不一樣的。

    cfDNABS-Seq送樣要求一、送樣類型分離好的血漿二、保存方式分離后的血漿,用ml離心管分裝,例如:1ml/管;放-20℃冰箱中保存(短暫保存,1-2周);放-80℃冰箱中長期保存(1年以內);保存期間不能凍融。三、運輸條件干冰運輸:順豐陸運(3-4天時間),夏季10-15公斤干冰;秋冬季10公斤干冰四、抽血要求1、使用Streck**管(不建議使用普通的EDTA-鈉抗凝管),采集10ml外周靜脈血(客戶沒有Streck**管,公司配送);2、室溫或者放置4℃冰箱中半小時以上,不超過8小時,進行血漿分離步驟五、血漿分離步驟1、4℃條件下以1600g離心10min,離心后將上清(血漿)分裝到2、4℃條件下以16000g離心10min去除殘余細胞,將上清移入新的離心管中,每管分裝1ml;3、血漿樣本存放于-80℃冰箱中保存;使用干冰運輸,提取之前不能凍融。備注1:血漿分離在4℃條件進行,如果客戶沒有冷凍離心機,也可以在室溫條件下進行;備注2:離心后取血漿上清,避免吸取白細胞;通常10ml全血可以獲得4-5ml血漿。

發(fā)育基因的表觀突變是養(yǎng)殖歐洲鱸魚開始馴化的基礎

Epimutations in developmental

genes underlie the onset of domestication in farmed European sea bass. Mol Biol Evol. 2019 May 30 (IF= 14.797)

本研究通過RRBS測序,比較了早期馴化的

(n=12)與野生的(n=12)

歐洲鱸魚在馴化過程中DNA甲基化變化,發(fā)現(xiàn)早期馴化的鱸魚與野生的沒有遺傳差異,但在不同胚胎起源的組織中發(fā)生DNA甲基化變化。這些甲基化突變與經(jīng)過25年選擇性育種后的胞嘧啶至胸腺嘧啶多態(tài)性***重疊,表觀突變基因與正選擇基因一致。結果表明馴化初始階的表觀變異是一個重要事件。 在哺乳動物中CpG以兩種形式存在。

熒光定量法(Methylight)


這種技術是在MSP技術上發(fā)展起來的,在MSP擴增過程中利用熒光染料進行定量。TaqMan? 探針法的應用使得該技術具有更高的精確性。其原理與SNP檢測類似,針對亞硫酸氫鹽處理之后的DN**段,在甲基化位點上會存在單堿基的差異,根據(jù)這種差異進行探針設計,隨后進行實時定量PCR,就能夠檢測甲基化的差異。這種方法**的優(yōu)勢在于其高敏感性和較高通量,且無需在PCR后電泳、雜交等操作,減少了污染和操作誤差。但是TaqMan? 探針訂購費用較高,適用于少數(shù)位點大量樣本篩選。 通過甲基化數(shù)據(jù)與耐藥基因Panel數(shù)據(jù)聯(lián)合分析。遼寧RIP-seq技術服務口碑推薦

焦磷酸測序能提供基于序列測定的SNP檢測、等位基因頻率分析和甲基化檢測。遼寧RIP-seq技術服務口碑推薦

GOS2基因靶向甲基化測序確定了一種快速復發(fā)、常規(guī)致死的腎上腺皮質*亞型

Targeted Assessment of G0S2

Methylation Identifies a Rapidly Recurrent, Routinely Fatal Molecular Subtype

of Adrenocortical Carcinoma. Clin Cancer Res. 2019; 25(11):3276-3288.

(IF= 10.199)

研究者分析了ACC-TCGA數(shù)據(jù),在114例腎上腺皮質**的**隊列中鑒定了一個在CIMP高ACC中***被高甲基化并沉默的基因G0S2,并通過高通量BSP得到驗證。G0S2基因CpG島高甲基化**預測不良臨床后果,是ACC快速復發(fā)或致死的標志。評估G0S2甲基化對臨床決策是直接可行的,并有助于對侵襲性ACC進行有效輔助***。 遼寧RIP-seq技術服務口碑推薦

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