dPCR的測量結果通常表示為含量,即拷貝數(shù)值或轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比,而QPCR結果通常表示為拷貝數(shù)的質(zhì)量分數(shù)。目前市場上可購買到大多數(shù)轉(zhuǎn)基因標準物質(zhì),以qPCR定值的標準物質(zhì)是以拷貝數(shù)(單倍體基因組當量)的質(zhì)量分數(shù)來表示特性量;以dPCR定值的標準物質(zhì)直接采用拷貝數(shù)比例來表示特性量。不同方法使用不同的表示方式,會造成測量結果不可比。因此質(zhì)量分數(shù)、拷貝數(shù)和拷貝數(shù)比例之間的關系需要轉(zhuǎn)化,才能得到單位一致,數(shù)值可比的數(shù)據(jù)。EU聯(lián)合研究中心建議使用轉(zhuǎn)換因子從拷貝數(shù)換算到質(zhì)量分數(shù)。影響dPCR定量結果的因素:儀器采用的分散方式與數(shù)量、溶液稀釋方法、分散體積的準確性以及結果表達方式。華南地區(qū)全自動多重數(shù)字PCR性能特點
現(xiàn)有dPCR分析方法采用熒光探針和基于光的檢測方法來鑒定擴增產(chǎn)物。這些方法要求足夠的靶分子擴增以產(chǎn)生足以被檢測到的信號,但可能會導致額外的錯誤或偏差,因此,希望能夠提供一種改進的、用于檢測樣品內(nèi)感興趣的核酸的方法,其采用替代性分析方法,具有提高的準確度和精確度,并且其具有可以與基于dPCR的方法關聯(lián)使用的靈敏度。dPCR還在樣品內(nèi)進行單一反應,但是所述樣品被分離成大量的分區(qū)(partition),并且所述反應在每個分區(qū)中單獨進行。這種分離允許對核酸量進行靈敏的測量。DPCR已被證明可有效用于研究基因序列中的變異,例如拷貝數(shù)變異或點突變。蘇州微滴式數(shù)字PCR解決方案經(jīng)過PCR循環(huán)之后,有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號,沒有模板的反應器就沒有熒光信號。
PCR(PolymeraseChainReaction)技術,即聚合酶連反應,是一種擴大和復制目的片段DNA的技術,其發(fā)現(xiàn)對于生命科學的發(fā)展具有重要的意義。而3D數(shù)字PCR到底是什么鬼?它其實是出現(xiàn)的一款PCR儀,其具有對目的DNA分子做出定量的優(yōu)點,進而提供的準確性、靈敏度。應用該技術,實現(xiàn)對DNA進行精確定量,精確度可通過復制次數(shù)實現(xiàn)。通過準確性的進行定量檢測基因,有助于臨床上在、病毒等疾病作參考。同時,其具有高通量,檢測速度快,成本相對低等優(yōu)點,為后期精細奠定基礎。
PCR常使用目標序列的拷貝數(shù)或某一給定樣品中轉(zhuǎn)基因的百分比來體現(xiàn)方法靈敏度。由于qPCR和dPCR實驗過程所用試劑的兼容性較好,在使用dPCR進行轉(zhuǎn)基因檢測時,通常直接參照qPCR的方法。使用不同技術對相同樣品檢測時,兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關注的問題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765(12板,每板765個微單元)芯片數(shù)字PCR分析儀測定標準物質(zhì)ERM-AD413檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810。該小組應用dPCR技術評估在qPCR定義下的靈敏度數(shù)值,在拷貝數(shù)200-700之間,dPCR與qPCR的測量結果具有一致性。但與qPCR的靈敏度相比,dPCR在低于拷貝數(shù)200時有被低估的風險,在高于拷貝數(shù)1000時有被高估的風險。dPCR在同一陣列上同時測量轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性靶點時,需要稀釋內(nèi)源性靶點和轉(zhuǎn)基因靶點在合理拷貝數(shù)范圍內(nèi)以保證dPCR測量結果的準確性。通過“儀器+試劑”相互配合的方式,打出了數(shù)字PCR檢測的“組合拳”。
微滴數(shù)字PCR主要是將兩種互不相溶的液體,以其中一種作為連續(xù)相(油),另一種作為分散相(水),在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續(xù)中,從而成液滴。這種液滴式的反應腔室具有體積小、樣品間無擴散等優(yōu)勢。在ddPCR中,利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,作為數(shù)字PCR的樣品分散載體。這里,液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液,然后將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。?PCR反應結束后檢測每個微滴的熒光信號。目前Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng)、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術的數(shù)字PCR系統(tǒng)。圖6.Bio-Rad的液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)dPCR被稱作第三代PCR技術,但dPCR技術的廣泛應用逐漸顯現(xiàn)出一些不足之處。華南地區(qū)賽默飛數(shù)字PCR系統(tǒng)
全自動數(shù)字PCR平臺,讓數(shù)字PCR真正邁入新時代,助推數(shù)字PCR普及應用。華南地區(qū)全自動多重數(shù)字PCR性能特點
dPCR的結果統(tǒng)計方式有2種,一種是采用標記多種顏色,通過不同檢測通道分辨不同顏色和強度,再根據(jù)分散液滴的數(shù)量計算待測基因的含量;另一種采用概率統(tǒng)計的數(shù)據(jù)處理方法,即通過泊松分布的方法對結果進行分析。應用概率統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)和對數(shù)據(jù)處理方法的模型直接關系著結果的準確性和分析時間的長短。常用的統(tǒng)計方法是假設每個微反應單元的體積相同,根據(jù)泊松統(tǒng)計計算拷貝數(shù),公式為:M=-Vx1n(1-x/)其中M是目標總拷貝數(shù)量;V是微反應單元數(shù)量;x是發(fā)光的微反應單元數(shù)量。華南地區(qū)全自動多重數(shù)字PCR性能特點
廣州雙螺旋科學儀器有限公司是一家從事數(shù)字PCR,純水機,病理切片機,倍性分析儀研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及售后的服務型企業(yè)。公司坐落在廣州市黃埔區(qū)銳豐三街4號617房,成立于2015-04-17。公司通過創(chuàng)新型可持續(xù)發(fā)展為重心理念,以客戶滿意為重要標準。在孜孜不倦的奮斗下,公司產(chǎn)品業(yè)務越來越廣。目前主要經(jīng)營有數(shù)字PCR,純水機,病理切片機,倍性分析儀等產(chǎn)品,并多次以精細化學品行業(yè)標準、客戶需求定制多款多元化的產(chǎn)品。我們以客戶的需求為基礎,在產(chǎn)品設計和研發(fā)上面苦下功夫,一份份的不懈努力和付出,打造了臻準,美國艾科浦,銳訊生物,Sysmex,Eprerdia產(chǎn)品。我們從用戶角度,對每一款產(chǎn)品進行多方面分析,對每一款產(chǎn)品都精心設計、精心制作和嚴格檢驗。廣州雙螺旋科學儀器有限公司以市場為導向,以創(chuàng)新為動力。不斷提升管理水平及數(shù)字PCR,純水機,病理切片機,倍性分析儀產(chǎn)品質(zhì)量。本公司以良好的商品品質(zhì)、誠信的經(jīng)營理念期待您的到來!